فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول: مقدمه

مقدمه ------------------------------------------------------------ 2

فصل دوم: بررسی منابع

10 کلزا-------------------------------------------------------------

2-1- خصوصیات کلی وعمومی کلزا--------------------------------------- 10

2-1-1- تاریخچه ومبدا ژنتیکی گیاه کلزا------------------------------------ 10

2-1-2- خصوصیات گیاه شناسی کلزا------------------------------------- 10

2-1-3- کشت و تولید کلزا-------------------------------------------- 11

2-1-4- برداشت کلزا------------------------------------------------ 13

2-1-5- ارقام وگونه های کلزا------------------------------------------ 14

2-1-6- مهمترین گونه های جنس براسیکا---------------------------------- 16

2-1-7- اهمیت اقتصادی وصنغتی کلزا------------------------------------- 17

2-2- اصلاح گیاه کلزا------------------------------------------------ 18

2-2-1- روشهای اصلاح کلزا------------------------------------------- 18

2-2-2- اهداف اصلاحی کلزا------------------------------------------- 19

2-3- گیاهان هاپلوئید------------------------------------------------- 20

2-3-1- مزایا و کاربردهای هاپلوئیدها-------------------------------------- 21

2-3-2- مشکلات ومحدودیت های هاپلوئیدها-------------------------------- 22

2-3-3- روشهای تولید گیاهان هاپلوئید------------------------------------- 23

2-3-3-1- تولید خود به خودی (روشهای طبیعی)----------------------------- 23

2-3-3-2- تولید القایی(روشهای آزمایشگاهی)------------------------------- 24

2-3-3-2-1- آندروژنز(نرزایی)----------------------------------------- 24

2-3-3-2-1-1- کشت بساک------------------------------------------- 25

2-3-3-2-1-2- کشت میکروسپور--------------------------------------- 25

2-3-3-2-2- ژینوژنز(کشت تخمدان وتخمک)------------------------------- 26

2-3-3-2-3- روش حذف کروموزومی------------------------------------- 27

2-4- کشت میکروسپورهای جدا گردیده کلزا--------------------------------- 28

2-5- عوامل موثر بر رویانزایی میکروسپورهای جدا گردیده کلزا--------------------- 29

2-5-1- شرایط رشد، فیزیولوژی و ژنوتیپ گیاه مادری--------------------------- 29

2-5-2- اندازه غنچه-------------------------------------------------- 32

2-5-3- مراحل تکاملی میکروسپورها--------------------------------------- 33

2-5-4- تراکم میکروسپور در محیط کشت----------------------------------- 35

2-5-5- ترکیب محیط کشت-------------------------------------------- 36

2-5-6- دما------------------------------------------------------- 40

2-6- مکانیسم رویانزایی----------------------------------------------- 43

2-6-1- مقدمه----------------------------------------------------- 43

2- 6-2- تقسیم قرینه هسته والقائ رویانزایی--------------------------------- 45

2-6-3- حوادث چرخه سلولی در طی رویانزایی میکروسپورها--------------------- 47 2-6-4- خانواده های ژنی درگیر با رویانزایی میکروسپورها در کلزا----------------- 47

2-7- عوامل موثر بر باززایی گیاه از رویانهای هاپلوئیدی کلزا---------------------- 48

2-7-1- بلوغ ،مرحله رشد ونمو رویانها------------------------------------ 48

2-7-2- اندازه رویانها--------------------------------------- --------- 49

2-7-3- محیط کشت------------------------------------------------ 50

2-7-5- BAP وژیبرلیک اسید------------------------------------------- 50

2-7-6- استفاده از کاغذ فیلتر در محیط کشت یا زراعی------------------------- 51

2-7-7- زغال فعال-------------------------------------------------- 51

2 -7-8- تیمار ABA و ابگیری رویانها------------------------------------- 51

2-8- موارد استفاده از کشت میکروسپورکلزا-------------------------------- 56

2-8-1- اصلاح نباتات و مهندسی ژنتیک----------------------------------- 56

2-8-2- موتا سیون و انتخاب ------------------------------------------ 56

2-8-3- کشت میکروسپوروتکنولوژی بذر مصنوعی--------------------------- 57

2-8-4- سیستم کشت میکروسپور در مطالعات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی------------- 57

2-8-5- استفاده در کشت و امتزاج پروتوپلاستها----------------------------- 57

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- مواد گیاهی-------------------------------------------------- 60

3-2- کشت بذور-------------------------------------------------- 60

3-3- شرایط اتاق رشد---------------------------------------------- 60

3-4- مراقبت های زراعی-------------------------------------------- 61

3-5- برداشت غنچه ها وتعیین مرحله مناسب میکروسپورها جهت جنین زایی--------- 61

3-6- محیط های کشت، ایزولاسیون وباززاییدر کشت میکروسپورهای کلزا----------- 62

3-6-1- محیط ایزولاسیون میکروسپورها---------------------------------- 62

3-6-2- محیط کشت میکروسپورها------------------------------------- 62

3-6-3-1- استریل کردن محیط کشت میکروسپورهای کلزا--------------------- 62

3-6-4- محیط کشت باززایی ، جنین های حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا------- 63

3-6-5- وسایل مورد نیاز جهت کشت میکروسپورهای کلزا--------------------- 68

3-7- روش انجام آزمایش کشت میکروسپورهای کلزا------------------------- 69

3-7-1- برداشت غنچه ها-------------------------------------------- 69

3-7-2- استریل کردن غنچه ها----------------------------------------- 69

3-7-3- استخراج میکروسپورها----------------------------------------- 69

3-7-4- تعیین تراکم میکروسپورها--------------------------------------- 70

3-8- آزمایشات انجام شده-------------------------------------------- 71

3-8-1-مطالعه اثرتراکمهای مختلف میکروسپوربرروی جنین زایی میکروسپورهای کلزا---- 71

3-8-2- مطالعه باززایی گیاه در جنین هایی با اندازه های مختلف حاصل از کشت

میکروسپورهای کلزا------------------------------------------------- 72

3-8-3- مطالعه اثراستفاده از کاغذ صافی یا کاغذ فیلتردر میزان ریشه زایی ،ارتفاع گیاهچه ها

ودرصد گیاهچه های نرمال--------------------------------------------- 73

3-8-4- مطالعه اثر استفاده ازشوک سرمایی بر روی درصد تشکیل گیاهچه های طبیعی-- 74

3-8-5- تعین سطح پلوئیدی گیاهچه های باززایی شده-------------------------- 75

3-9- تجزیه و تحلیل داده ها-------------------------------------------- 78

فصل چهارم:نتایج وبحث

4-1- جنین زایی میکروسپورهای کلزا در تراکمهای مختلف میکروسپور در محیط کشت---- 82

4-2- اثراندازه های مختلف جنین برروی صفات باززایی جنین های حاصل ازکشت

میکروسپورهای کلزا-------------------------------------------------- 84

4-3- اثراستفاده ازکاغذ صافی یا کاغذ فیلتردر میزان ریشه زایی ،ارتفاع گیاهچه ها

ودرصد گیاهچه های نرمال--------------------------------------------- 90

4-4- اثر استفاده ازشوک سرمایی بر روی درصد تشکیل گیاهچه های طبیعی---------- 97

4-5- پیشنهادات--------------------------------------------------- 105

منابع مورد استفاده-------------------------------------------------- 107

مقدمه :

گیاه کلزا مهمترین گونه زراعی جنس براسیکا (Brassica) میباشد. و ویژگیهای خاص این گیاه یعنی قابلیت کشت در نقاط مختلف ، در صد بالای روغن آن ، کیفیت مطلوب روغن ، کاربرد روغن آن در صنایع نساجی و پلاستیک و نیز استفاده از کنجاله آن در تغذیه دام سبب شده است که توسعه کشت این گیاه بعنوان نقطه امیدی جهت تامین روغن خام مورد نیاز کشور و رهائی از وابستگی بشمار رود .بطوریکه در حال حاضر کلزا نقطه ثقل طرحهای افزایش تولید دانه های روغنی محسوب میگردد. دانه‎های روغنی قسمت مهمی از تولید محصولات کشاورزی را شامل می‎شوند، چون علاوه بر مصارف صنعتی از لحاظ تغذیه نیز اهمیت بسزایی دارند. سطح زیر کشت دانه‌های روغنی در سال 1383 (بجز کنجد که در سیستم روغن کشی وارد نمی‌شود) 319 هزار هکتار و محصول تولید شده (دانه) حدود 400 هزار تن بوده ‌است. مصرف روغن نباتی در سال 1383 بالغ بر 1180 هزار تن بوده‌است که 170 هزار تن از آن معادل حدود 4/14 درصد، از تولید داخل تامین شده ‌است ( بی نام ، 1382 ). کلزا به عنوان یک گیاه روغنی با بیش از 40% روغن در دانه از گیاهان مهم جهت توسعه کشت نباتات روغنی وتولید روغن نباتی در ایران است. کلزا با نام علمی Brassica napus و نام انگلیسی Rapeseed گیاهی از تیره Brassicacea ( چلیپائیان یا شب بو ) می‎باشد که پس از سویا و نخل روغنی مقام سوم را در تأمین روغن نباتی جهان به خود اختصاص داده است که در حدود 7/14% کل تولید روغن نباتی جهان را تأمین می‎کند. این گیاه در برابر خشکی و سرما مقاوم بوده و به دلیل سازگاری، دامنه کشت وسیعی دارد ( دهشیری 1378 ). روشهای سنتی (کلاسیک) اصلاح نباتات از دیر باز برای تولید گیاهان زراعی برتر مورد استفاده قرار میگرفته است که مبتنی بر ایجاد تغییر در ساختار ژنتیکی گیاه کامل در جهت هدف خاصی با استفاده از تلاقیهای بین جنسی ودرون جنسی بوده است.

روشهاییکه جهت اصلاح گیاهان خود گشن بکار گرفته میشوند٬ عمدتا روشهای گزینش (Selection) و یا دورگ گیری (Hybridization) است که در مورد اول از تنوع ژنتیکی موجود در توده های طبیعی و بومی استفاده شده و واریته های اصلاح شده ای که نسبت به جامعه اولیه برتری هائی از نظر کمی و کیفی دارند بوجود می آیند. شانس موفقیت در این روش نسبتا کم است زیرا به غنای ژنتیکی توده های محلی بستگی دارد که امروزه رو به کاهش بوده و کمتر قابل دسترسی است. در مقابل روشهای مبتنی بر تلاقی به اصلاحگر این امکان را میدهد که بطور هدفدار صفات مطلوب واریته های مختلف را با یکدیگر تلفیق نماید(Poehlman and Mitton , 2003).

یک پروژه اصلاح نباتات از زمان انجام دورگ گیری تا آماده شدن واریته جهت کشت ، حدودا 10 تا 15 سال زمان صرف می شود لذا امروزه متخصصین اصلاح نباتات به دنبال روشهائی هستند که بتوان این مدت زمان را به حداقل ممکن رسانید تا در وقت و هزینه های سنگین برنامه های اصلاح نباتات صرفه جوئی شود. برای این کار سعی بر اینست که بتوان با ایجاد تغییرات ژنتیکی در سطح سلول ، زمان لازم برای تهیه ارقام پر محصول با کیفیت بالا و مقاوم به بیماری و یا تنشهای محیطی را در برنامه های به نژادی کوتاه کرد(اصلانی و همکاران ، 1381).

کلزا گیاهی‎ خودگشن‎-‎ دگرگشن می‎باشد ودرصد دگرگشنی آن در ارقام مختلف بین 33%-22% گزارش شده است ( شهیدی و فروزان ، 1376 ). این گیاه آلوتتراپلویید (38=x4=n 2) می‎باشد.روشهای سنتی اصلاح نباتات در چند دهة اخیر نقش بسیار مهمی در اصلاح عملکرد و کیفیت کلزا داشته اند که از میان این روشها می توان به روش انتخاب توده ای[1] و گزینش شجره ای[2] اشاره کرد. از معایب این روشها طولانی بودن دورة آنها می باشد. امروزه متخصصین اصلاح نباتات به دنبال روشهای دیگری هستند که بتوانند این مدت را به حداقل ممکن برسانند تا در وقت و هزینه های سنگین برنامه های اصلاح نباتات صرفه جویی شود. یکی از این روشها اصلاح از طریق سیستم دابل هاپلوئیدی[3] می باشد، که به عنوان وسیله ای برای ترکیب صفات یک تلاقی می تواند مکمل روش شجره ای باشد. اهمیت استفاده از گیاهان هاپلوئید در برنامه های اصلاح نباتات از مدتها پیش برای دانشمندان مسلم گردیده است و یکی از موضوعات مهم تحقیقاتی در این زمینه، تولید لاینهای هموزیگوس جهت تولید گیاهان هیبرید در گونه های خودناسازگار می باشد. با تولید لاینهای کاملاً هموزیگوت در این روش 5-3 سال در زمان برنامه های اصلاحی صرفه جویی می شود. سیستم دابل هاپلوئیدی در صورتی موفق است که به توان گیاهان هاپلوئید ودابل هاپلوئید تولید کرد، بدین منظور قبل از استفاده از این سیستم آزمایشاتی را در جهت بهینه سازی گیاهان می بایست انجام داد. روشهای متعددی جهت تولید گیاهان هاپلوئید و به دنبال آن گیاهان دابل هاپلوئید وجود دارد که یکی از این روشها آندروژنز[4] می باشد.

آندروژنز به دو روش انجام می شود : الف ـ کشت بساک[5] ب ـ کشت میکروسپور[6] . کشت میکروسپور اخیراً به لحاظ مزایای آن بر کشت بساک، مورد توجه قرار گرفته است. در این روش امکان تولید تعداد زیادی گیاهان هاپلوئید وجود دارد. تولید سریع لاینهای خالص از میکروسپورهای جدا شده، مهمترین ویژگی این روش در برنامه‌های اصلاحی می باشد. همچنین با توجه به فراوانی بالای تولید گیاه از کشت میکروسپور و نیز سهولت انتقال ژن ، کشت میکروسپور ، کارآمدترین و بهترین اندام هدف در انتقال ژن به شمار می آید و دانشمندان امیدوارند که در آینده ای نزدیک از این روش به عنوان یک روش متدوال در مهندسی ژنتیک استفاده نمایند. میکروسپورهای گیاهان F₁ می توانند لاینهای دابل هاپلوئید بسیاری تولید کنند تا برای ترکیب مطلوبی از صفات گزینش شوند. لاینهای انتخابی، کاملاً خالص هستند و از نظر یکنواختی و پایداری برای به نژادگران مشکلات کمتری به دنبال دارند .(Mohan Jain et al., 1996) تولید رویانهای هاپلوئید و به دنبال آن تولید گیاهان دی هاپلوئید در کلزا از اهمیت ویژه ای برخوردار می باشد . در طبیعت تولید گیاهان هاپلوئید به صورت خود‎به‎خودی، درگونه‏های Brassica در فراوانی بسیار پایین (حدود 4/19-05/0 در هزار گیاه ) اتفاق می‎افتد ( Banga and Labana , 2003 ) . اما به هر جهت بهره وری واقعی از هاپلوئیدهای ردهBrassica با کشف روشهای القاء رویان از بساکها و میکروسپورهای جدا شده در شرایط درون شیشه ای آغاز گردید . گیاهان هاپلوئید زیادی بطور رایج توسط کشت بساک یا میکروسپورهای جدا شده تولید می شوند، اگرچه تنوع قابل ملاحظه ای بین گونه‎ها ، واریته‎ها و ارقام مختلف وجود دارد ، اما تکنیکهای کشت میکروسپور جدا شده و کشت بساک به طور موفقیت‎آمیزی برای اکثرگونه‎ها و واریته‎های تجاری رده Brassica استفاده شده است و در سالهای اخیر پیشرفتهای چشمگیری در این زمینه بدست آمده است ، به طوریکه ‎ رویان زایی میکروسپور در B. napus یکی از کامل‎ترین سیستم‎ها برای تولید گیاه در شرایط درون شیشه ای[7] است((Burnett et al., 1992 .

تکنیک باززایی گیاه از رویانهای حاصل از کشت میکروسپور برای اصلاح نباتات و مهندسی ژنتیک ضروری است اما گزارش شده است که اکثر رویانها به گیاهچه تبدیل نمی‌شوند و به صورت غیر طبیعی باززایی می‌شوند یا اینکه رویانهای ثانوی را تشکیل می‌دهند. ( Takahata,1997 ) همچنین عدم باززایی یا باززایی بسیار اندک رویانهای هاپلوئید به خصوص در کشت پرچم نیز گزارش گردیده است ( Bruins and Snijder, 1995 ) . در ایران ، برای اولین مرتبه آزمایشاتی در زمینه رویان زایی و باززایی در قالب پایان‎نامه کارشناسی‎ارشد در دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس انجام شد ‎‎که موفقیت چشمگیری نیز حاصل شد. در اولین تحقیق ( باقری ، 1379 )، سه رقم بهاره ( F704, Global, Maluka ) وسه رقم پاییزه کلزا (Ceres Slmo46, Bounty, ) از لحاظ پاسخ به کشت میکروسپور مورد ارزیابی قرار گرفتند که در دو آزمایش هیچ رویانی بدست نیامد، اما در آزمایش آخر، از 36 پتری‎دیش کشت شده حدود 20 رویان حاصل شد و رقم Bounty در رویان زایی و باززایی گیاه، به عنوان بهترین ژنوتیپ شناخته شد. در تحقیق دیگر ( خنجی ، 1380 )، پاسخ به کشت میکروسپورهای جدا شده کلزا در یک رقم بهاره ( Global ) و دو رقم پاییزه ( Okapi و Colvert ) مورد بررسی قرار گرفت. رقم Global به عنوان بهترین رقم در بین ارقام استفاده شده از نظر پاسخ دهی به کشت میکروسپور کلزا شناخته شد و در هر پتری‎دیش کشت شده، حدود 22% رویان بدست آمد. در تحقیق دیگر ( عبدالهی ، 1381 )، اثر تراکم، اثر شوک حرارتی و اثر تعویض محیط کشت بر روی رویان زایی، واثر اندازه های مختلف رویان بر روی باززایی گیاه در رقم بهاره کلزا ( Global ) مطالعه شد. در این تحقیق، بالاترین میزان رویان زایی در تراکم 40000 میکروسپور در هر میلی‌لیتر محیط کشت بدست آمد. تعویض محیط کشت، میزان رویان زایی میکروسپورهای کلزا را در تراکم های مختلف میکروسپور افزایش داد و رویانهای5 میلیمتری، بهترین باززایی را نشان دادند. در تحقیق دیگر ( حبیبی ، 1382 )، اثر حجمهای مختلف محیط کشت بر روی رویان زایی و اثر شوک حرارتی و زغال فعال بر روی باززایی گیاه رقم بهاره کلزا ( PF ) مطالعه شد. در این تحقیق، بالاترین میزان رویان ‌زایی در پتری‌دیشهایی با قطر cm 10 و حجمهای محیط کشت ml 5/12 و ml 10 بدست آمد. همچنین مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف زغال فعال در محیط کشت باززایی بر روی درصد تشکیل گیاهچه‌های طبیعی نشان ‌داد، که غلظتهای مختلف زغال فعال در سطح 5% با هم اختلاف معنی‌داری را نشان می‌دهند، بطوریکه میزان l^-1 g 125/0 زغال فعال با تولید 40% گیاهچه کاملاً طبیعی، در گروه a قرار گرفت .

در این تحقیق سعی بر این است تا شرایط برای باززایی گیاهان حاصل از رویانهای بدست آمده از میکروسپورها بهینه ‎سازی شود، برای این منظور اثرات مختلف شوکهای سرمائی و نیز آبگیری رویانها و اثر استفاده از کاغذ صافی مورد آزمایش و مطالعه قرار گرفت ، تیمار آبگیری رویانها با تسریع در بلوغ رویانها ( Wang et al., 2002 ) ، درصد باززایی گیاهان را افزایش می دهند. در ارتباط با مطالعه اثرشوکهای سرمائی، سرمای هوا نیز می تواند بر روی تبدیل رویان به گیاه موثر باشد.

در هنگام انجام این تحقیق سوالهائی از قبیل سوالات ذیل مطرح بودندکه پاسخ به آنها به تفصیل در قسمت مربوطه آورده شده است .

1- آیا اعمال شوکهای سرمائی می‎تواند اثر معنی داری بردرصد باززایی گیاهان کلزای مورد مطالعه داشته باشد ؟

2- آیا استفاده از کاغذ صافی می‎تواند اثر معنی داری روی درصد باززایی گیاهان کلزای مورد مطالعه داشته باشد؟

3- آیا اثر تراکمهای مختلف میکروسپورها بر روی جنین زائی میکروسپورهای کلزا اثر معنی داری دارد؟

4- آیا باززائی گیاه سبز در جنین هائی با اندازه های مختلف حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا با هم تفاوت معنی داری دارند؟

بوجود آمده است. B.oleracea وB.rapa های کلزا گیاهی آلو تترا پلوئیدست.که از تلاقی بین گونه

یکی از روشهای ٬ کشت میکروسپور کلزا و سپس باززایی جنینهای بدست آمده از کشت میکروسپور می باشد. دراین تحقیق که در سازمان انرژی اتمی اجرا شد مشخص گردید که استقاده از تیمارهای مختلف٬ در میزان باززایی جنین ها موثر است. در آزمایش اول اثرتراکمهای مختلف ( ml٬20000 ml30000 وml 40000 ) میکروسپور بر روی جنین زایی میکروسپورهای کلزا در رقم گلوبال مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که هر سه تراکم در سطح 1%با هم اختلاف معنی داری دارند . تراکمml 40000 میکروسپور (باتولید 33/1031% جنین) بالاترین و تراکمml 20000 میکروسپور ( با تولید 72/137% جنین) پایین ترین گروه میزان جنین زایی را داشتند.درحالیکه تراکمml 30000 میکروسپوربا52/413جنین در گروه حدواسط قرارگرفت.درآزمایش دیگراثراندازه های مختلف جنین بر روی صفات باززایی جنینهای حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا در رقم گلوبال موردمطالعه قرارگرفت٬ که این صفات عبارت بودنداز: 1.تولیدنوساقه:که درجنینهای بزرگتر از 6میلیمتر دارای بیشترین مقدارست. 2.کالزایی برروی لپه:که اندازه های مختلف جنین در سطح 1% و 5% اختلاف معنی داری با هم ندارند. 3.تولیدبرگ:که در جنین های بزرگتر از 6 میلیمتردارای بیشترین مقدارست. 4.تولیدجوانه های نابجا:که درجنینهای 5 تا6 میلیمتری دارای بیشترین مقدارست. 5.ریشه زایی:که در سطح 1%دارای اختلاف معنی داری میباشد . در آزمایش دیگر مطالعه اثر استفاده از کاغذ صافی در میزان طول ریشه ٬ ارتفاع گیاهچه ودرصد تولید گیاهچه های نرمال در دو رقم گلوبال و آپشن مورد مطالعه قرار گرفت . نتایج حاصل از این آزمایش در میزان طول ریشه ٬ارتفاع گیاهچه وتولید گیاهان نرمال بیانگر آنست که در رقم گلوبال در دو حالت با کاغذ و بدون کاغذ فیلتر نسبت به رقم آپشن دارای طول ریشه و ارتفاع گیاهچه بیشتری بودند . ولی در حالت اثر متقابل نوع رقم با کاغذ فیلتر دارای اختلاف معنی داری نبودند در آزمایش دیگر اثر استفاده از شوک سرمایی بر روی درصد تشکیل گیاهچه های طبیعی در دو رقم گلوبال و آپشن مورد مطالعه قرار گرفت . که در این آزمایش مشاهده شد که تشکیل گیاهچه های طبیعی در دمای 4 درجه به مدت 10 روز در دو رقم گلوبال و آپشن با95/55% دارای بیشترین مقدار تولید بودند.

- 1- مواد گیاهی

ارقام مورد استفاده در این آزمایش2 رقم گلوبال وآپشن از تیپهای بهاره ودوصفر می باشند و در چند سال اخیر کشت آنها در ایران رایج شده است.

3- 2- کشت بذور

بذور کلزا در داخل گلدانهایی با قطر cm25 کشت گردیدند. خاک مورد استفاده شامل دو قسمت خاک معمولی، یک قسمت خاک برگ، یک قسمت کود دامی، یک قسمت ماسه بود. در داخل هر گلدان 5 الی 6 بذر در قسمتهای مختلف گلدان کشت گردید و گلدانها پس از کشت بذور در داخل اتاقک رشد گروه اصلاح نباتات سازمان انرژی اتمی بخش کشاورزی هسته ای قرار گرفتند. دو هفته پس از سبز شدن بذور و اطمینان از رشد گیاهچه‌ها، در هر گلدان 2 بوته حفظ گردیده و بقیه حذف شدند.

3- 3- شرایط اتاق رشدin vivo

نور اتاق رشدی که گلدانها در آن قرار داشتند با 6 لامپ 400 وات بخار سدیم تأمین می شد لامپها در ارتفاع 4/1 متری از سطح گلدانها قرار داشتند و شدت نور در اتاق رشد 30000 لوکس بود. از لحاظ فتوپریودی اتاق رشد روی 8/16 ساعت تاریکی و روشنائی و دمای روز و شب°C10/ °C15 تنظیم شده بود.

3- 4- مراقبت‌های زراعی

مراقبت‌های زراعی، شامل آبیاری، سم پاشی، محلول پاشی بود. برنامة آبیاری هر سه روز یکبار انجام گرفت. از نظر کنترل آفات و بیماریها یکی از آفاتی که به وفور در فیتوترون دیده ‌شد شته بود که جهت دفع آنها از دیازینون 2/1 در هزار و متاسیستوکس 1 در هزار استفاده گردید و برنامة سم پاشی در هر دورة رشد گیاهان 2 مرتبه انجام گرفت. یکی از کارهایی که جهت جلوگیری از شیوع آفات و بیماریها انجام گرفت حذف برگهای زرد و مرده در قسمت تحتانی گیاه بود که در هر هفته یک بار این عمل انجام ‌گرفت.به منظور تقویت گیاهان مادری از کودهای مغذی کامل استفاده گردید که این کود به صورت محلول پاشی هر دو هفته یکبار روی برگ گیاهان اسپری شد.

3- 5- برداشت غنچه‌ها و تعیین مرحلة مناسب میکروسپورها جهت جنین‌زایی

گیاهان کلزای بهاره پس از 35 ـ 45 روز از کشت به تدریج شروع به غنچه‌دهی کردند که به منظور تعیین مرحلة مناسب میکروسپورها جهت جنین‌زایی، یک آزمایش سیتولوژیکی روی غنچه‌ها انجام گرفت. بدین ترتیب که غنچه هایی با اندازه‌های مختلف 2-1، 3-2، 4-3، 5-4 و 6-5 میلیمتر از گیاهان مختلف به طور تصادفی انتخاب شدند. پس از انتخاب غنچه‌ها با اندازه‌های فوق، از هر غنچه یک پرچم با پنس برداشته شد و روی لام قرار داده شد. سپس یک قطره استوکارمن 2% به آن اضافه گردید و با نوک سوزن پرچم را له کرده و دیواره و قسمتهای اضافی پرچم حذف گردید. سپس یک لامل روی آن قرار داده شد. و پس از تهیة نمونه از غنچه ها با اندازه های مختلف، نمونه‌ها در زیر میکروسکوپ از نظر سیتولوژیکی بررسی شدند و مرحلة میکروسپور در هر نمونه تعیین گردید.

3- 6- محیط‌های کشت، ایزولاسیون و باززایی در کشت میکروسپورهای کلزا

3- 6- 1- محیط ایزولاسیون میکروسپورها

محیط جداسازی یا استخراج میکروسپورها میکروسپورها را از سایر قسمت‌های غنچه که طی آسیاب شدن ایجاد می‌شوند، جدا می‌کند.محیط استخراج میکروسپورها در این آزمایش طبق یک پروتکل کانادایی تهیه گردید..(Fletcher et al., 1998) برای تهیة این محیط جداسازی g130 ساکاروز در داخل 1 لیتر آب حل گردید وpH محلول حاصل روی 6pH= تنظیم گردید. و پس از تهیة آن به مقدارml 150 در هر ارلن توزیع کرده و جهت استریل شدن در اتوکلا و با دمای °C121 و فشار 2/1 بار قرار گرفتند.محیط ایزولاسیون میکروسپورها پس از اتوکلاو شدن در دمای°C4 ، در داخل یخچال نگهداری شدند.

3- 6- 2- محیط کشت میکروسپورها

محیط کشت مورد استفاده در این آزمایش(Kott., 1998) NLN-13 می باشد که میکروسپورهای استخراج شده در این محیط کشت می‌گردند. به منظور تهیة محیط کشت NLN-13 طبق پروتکل از محلولهای مادری تهیه شده به مقدار مورد نیاز برداشته شد و سپس g130 ساکاروز به آن اضافه گردید و حجم محلول به 1 لیتر رسانده شد ودر نهایتpH آن روی 6 تنظیم گردید.

3- 6- 3- استریل کردن محیط کشت میکروسپورهای کلزا

به خاطر حساس بودن بعضی ویتامین‌ها به گرمای اتوکلاو استریل کردن محیط کشت با دستگاه فیلتراستریلیزاسیون انجام گرفت. بدین ترتیب که ابتدا فیلتری با سوراخ‌هایی به قطرµm 22/0 روی دستگاه نصب ‌گردید و سپس دستگاه فیلتراستریلیزاسیون در داخل فویل آلومینیم پیچیده شده و در دمای°C121 و فشار 2/1 بار استریل گردید. پس از عبور تمام محیط کشت از فیلتر، در حالی که دستگاه روشن است درپوش لاستیکی طرف دیگر دستگاه را به آهستگی باز کرده و سپس پمپ خلاء خاموش می گردد. در این مرحله عمل فیلتراستریلیزسیون محیط کشت تمام می‌شود و محیط کشت داخل مخزن در داخل بطری‌های درب آبی استریل شده به میزانml 200 در هر بطری توزیع می‌گردد. بطری‌های حاوی محیط کشت استریل شده به مدت 3-2 روز در دمای اتاق قرار می گیرند و پس از اطمینان از استریل بودن آنها در داخل یخچال در دمای °C4 نگهداری می شوند.

3- 6- 4- محیط کشت باززایی برای جنین‌های حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا

محیط کشت باززایی استفاده شده در این آزمایش، محیط حاویmgl-11/0 جیبرلیک اسید (kott et al., 1998) می باشد. بدین ترتیب که برای تهیه یک لیتر محیط کشت باززایی پس از تهیة محلولهای مادری از جمله محلولهای مادری ماکروالمنت، میکروالمنت, محلول مادری ویتامین‌ها و محلول مادری یدید پتاسیم, از هر کدام مطابق پروتکل موجود به مقدار مورد نیاز برداشته شد و هورمون اسید جیبرلیک، اضافه گردیده سپس 2% ساکاروز وgl-18 آگار به محیط باززایی اضافه شد.

در نهایت حجم محلول به 1 لیتر رسانده شد وpH آن روی 7/5 تنظیم گردید و در دمای °C121 و فشار2/1 بار به مدت 20 دقیقه استریل گردید. پس از استریل کردن، محیط کشت باززایی در زیر لامنیارایرفلو در شرایط کاملاً استریل در پتری دیش‌های شیشه ای به ابعاد mm 15×100 توزیع گردید و تا زمان انتقال جنین‌ها، پتری دیش‌ها در داخل پلاستیک محافظ غذا پیچیده شدند و در داخل یخچال نگهداری شدند