پژهش بررسی جامع زراعت در 70 صفحه ورد قابل ویرایش

فهرست مطالب :

مقدمه ……………………………………………………………………………………………..1

انواع کشت درون شیشه ای …..…………………………………………………………………….3

کاربردهای کشت بافت گیاهی ……………………………………………………………………….4

روشهای سترون سازی ………..…………………………………………………………………...7

1- روش حرارت خشک …………………………………………………………………………..10

2- روش حرارت مرطوب ………………………………………………………………………..12

3- روش الترا فیتراسیون ……………………………………………………………………….15

4- روش استریلیزاسیون شیمیایی …….…………………………………………………….….16

نحوه تاثیر حرارت های بالا بر روی اجزای مدیوم کشت…………………………………………..…20

روش های پیشگیری از آلودگی ……………………………………………………………….......22

اجزای غذایی تشکیل دهنده مدیوم کشت بافتهای گیاهی………………………………………….….24

1- املاح معدنی….………………………………………………………………………….….24

2- مواد تنظیم کننده رشد گیاهان..…….…………………………………………………….…..27

3- ویتامینها ….………...…………………………………………………………………….31

4- اسیدهای آمینه و آمید ها ….……………………………….………………………………..33

5- مکملهای آلی کمپلکس ….……………………………………………………………………34

6- ذغال ………………………………………………………………………………………35

7- منابع کربن ……………………………………………………………………………......36

8- مواد تنظیم کننده فشار اسمزی …..…………………………………………………………38

9- آب……………………………………………………………………………………..…39

10-ماده زمینه مدیوم کشت …….………………………………………………………………40

نحوه انتخاب مدیوم کشت…………………………………………………………………….....42

تهیه ریز نمونه…………………………………………………………………………………44

عوامل مربوط به گزینش ریز نمونه……….………………………………………………….….45

ایجاد و نگهداری کشت کالوس………….……………………………………………………......48

روش کار………………………..…………………………………………………………...57

نحوه بررسی نتایج بدست آمده……………..……………………………………………..…64

کشت سلول، بافت و اندام گیاهی.…………………………………………………………..…65

رشد و نمو گیاهان……………..……………………………………………………...……...66

کشت بافت گیاهی ………………………………………………………………………..…69

کشت سلول گیاهی ………………………………………………………………………….70

پروتو پلاستها ……………………………………………………………………………71

کشت اندام گیاهی ……………………………………………………………………..…..72

باز زایی گیاهان …………………………………………………………………………73

تکثیر گیاه در مقیاس بزرگ ……………………………………………………………….76

بانکها ی نطفه گیاهان ……………………………………………………………………77

منشاء ماهیت و اهمیت تنوع در کشت بافت …………………………………………………79

اساس تنوع سوماکلونال ………………………………………………………………… 81

تنوع ژنتیکی حاصل از گیاه پایه……………………………………………………………81

تنوع ژنیتکی ایجاد شده در مدت زمان کشت …………………………………………………82

دلایل تنوع سوماکلونال ……….……………………………………………………………..،،..83

ژنوم سیتوپلاسمی و تنوع سوما کلونال ………………………………………………………….85

دلایل تنوع اپی ژنیتک در کشت بافت ….………………………………………………………….85

استفاده از تنوع سوماکلو نال در اصلاح ..……………………………………………………..…89

فهرست منابع ………………………………………………………………………………….90



مقدمه :

کشت بافت گیاهی بطور خلاصه شامل کشت پروتوپلاست ,سلول,بافت و اندام گیاهی است. در همه این کشتها, رشد ماده گیاهی عاری از میکروب در یک محیط سترون مثل محیط کشت مغذی سترون در یک لوله آزمایش صورت می گیرد.در سال های اخیر, تکنیک های کشت بافت گیاهی به یک ابزار خیلی قوی برای تکثیر و اصلاح گونه های گیاهی زیادی تبدیل شده اند. این تکنولوژی با پژوهش گتلیب هابرلنت(Gottlieb Haberlandt) در مورد پر توانی سلول در اوایل قرن 20 شروع شد.وی با توجه به این نکته که با دستکاری محیط کشت سلولها , سلولهای کشت شده مراحل نموی یک رشد عادی را تکرار خواهند نمود , پیشنهاد گسترش تکنیک های جداسازی و کشت بافت های گیاهی را ارائه داد.

کشت اکسین ها توسط ونت Wentو همکاران و کشف سیتوکنین ها توسط اسکوگSkoog و همکاران, قبل از اولین کشت موفق بافت های گیاهی در آزمایشگاه صورت گرفت (گاتریت,1934 : نوبکورت , 1939).

اولین کشت موفق کالوس هویج و توتون توسط وایتWhite(1943)گزارش گردید. اسکوگ و میلر Miler(1957)گزارش کردند که اثر متقابل کمی بین اکسین ها و سیتوکنین ها نوع رشد و ریخت زایی گیاه را تعیین میکند. مطالعات آنها بر روی توتون نشان داد که نسبت بالای اکسین به سیتوکنین, ریشه زایی را تحریک نموده و پایین بودن این نسبت, باعث تحریک تشکیل اندام هوایی می شود اما این پاسخ, عمومی نیست. با این که دستکاری نسبت اکسین و سیتوکنین در ریخت زایی گونه های زیادی موفقیت آمیز بوده است, اما امروزه واضح است که عوامل زیاد دیگری بر توانایی سلولها در کشت برای تمایز ریشه, اندام هوایی و یا رویان موثر هستند.

ایجاد انگیزه برای بکارگیری تکنیک های کشت بافت گیاهی در تکثیر و اصلاح گونه های گیاهی از کار اولیه مورلMorel(1960) روی تکثیر ارکیده در محیط کشت و تهیه یک محیط کشت جدید با غلظت بالایی از نمک های معدنی توسط موراشیکMurashige و اسکوت(1962)ناشی شد. از آن به بعد, این تکنولوژی به صورت قابل توجهی رشد یافت و امروزه یک نقش کلیدی در تکثیر, اصلاح و مهندسی ژنتیک گیاهی ایفا می کند.

کشت بافت های گیاهی بر پایه سه قابلیت گیاهی استوار است :

1- پر توانی Totipotency, که توان یا ظرفیت توارثی یک سلول گیاهی برای نمو به یک گیاه کامل با القای تحریک مناسب است . پر توانی بر این مطلب دلالت می کند که هر سلول واجد تمام اطلاعات لازم برای رشد و تکثیر می باشد. گرچه از لحاظ نظری همه سلولهای گیاهی پر توان هستند, با این حال سلولهای مریستمی بیشترین توان بیان این ویژگی را دارند .

2- تمایز زداییDedifferentiation , که توان سلولهای بالغ برای بازگشت به شرایط مریستمی است و بعد از آن سلولها با باز تمایزیRedifferentiation اندام های جدیدی را سازماندهی می کنند .

3- شایستگی Competency , که توانایی ذاتی یک سلول یا بافت گیاهی را برای نمو در یک مسیر مشخص بیان می کند. برای مثال , سلول های با شایستگی رویانی توانایی تبدیل شدن به رویان های کاملا فعال را دارند. در مقابل این اصطلاح , واژه ناشا یستگی یا ناتوانی ریخت زایی بیان می شود.

انواع کشت درون شیشه ای :

1- کشت گیاهان کامل ( برای مثال: کشت بذر ارکیده , کشت دانه رست Seedling)

2- کشت رویان (برای مثال : کشت رویان نارس )

3- کشت اندام ( برای مثال : کشت مریستم )

· کشت شاخساره Shoot tip
· کشت ریشه
· کشت برگ
· کشت بساک

4- کشت کالوس

5- کشت معلق و کشت سلولهای منفرد

6- کشت پروتوپلاست

کاربردهای کشت بافت گیاهی :

عمومی ترین دلایل بکارگیری تکنیک های درون شیشه ای برای تولید گیاه در جدول -2 خلاصه شده است اما مهم ترین کاربرد آن در این قرن,استفاده از تکنولوژی ژن برای بهبود محصولات است. اهمیت گیاهان برای بشر بر کسی پوشیده نیست. ما به گیاهان برای غذا, فیبر, سوخت, دارو و مسکن وابسته ایم .

بنابراین, جای تعجب نیست که بیشتر فعالیت بشر در جهت افزایش و تولید گیاهی با خصوصیات مفید متمرکز می شود.

روش های مرسوم برای اصلاح گیاهان زیاد بررسی شده اند. اما این روش ها محدودیت هایی دارند. پیشرفت قابل توجه در دانش ما از مکانیسم های ملکولی و سلولی که فعالیت ها و اعمال سیستم های زنده را پشتیبانی می کنند ما قادر به توسعه روش های جدید در بهبود گیاهان نموده است. این تکنیک ها بر روی کاربرد زیست شناسی ملکولی و سلولی تاکید می کنند. سهم بیوتکنولوژی گیاهی از طریق دست ورزی ژن فقط محدود به افزایش عملکرد محصولات یا تولید وسایلی برای پیشگیری از آسیب آفات و امراض نمی شود , بلکه ما را در افزایش کیفیت غذا و روش استفاده از زمین یاری می دهد . بنابراین , بیوتکنولوژی گیاهی توانایی قابل توجهی برای رشد و افزایش کیفیت زندگی و سلامتی بیوسفر دارد.



















جدول 1-2- کاربردهای کشت بافت گیاهی :

ü تکثیر کلونی سریع و در مقیاس وسیع گیاهان یکسان از یک منبع گیاهی برتر

ü حذف عوامل بیماری زا , همچنین تسهیل انتقال ماده گیاهی از راه مرزهای بین المللی.

ü تهیه منابع عاری از بیماری به صورت کشت درون شیشه ای .

ü ذخیره ژرم پلاسم و ذخیره بلند مدت منابع گیاهی.

ü گزینش جهش یافته ها از جهش های خود بخودی یا القایی.

ü تولید ریز قلمه های ریشه دار شده در گونه های زینتی چوبی سر سخت.

ü باز یابی دو رگها از گونه های ناسازگار توسط کشت رویان یا تخمک.

ü تولید گیاهان هاپلوئید از راه کشت بساک. گیاهان هاپلوئید ممکن است برای بازیابی جهش های مغلوب در برنامه های اصلاحی استفاده شوند. باز زایی متوالی, باعث تولید هاپلوئیدهای مضاعف شده هموزیگوس شده و بنابراین لاین های اصلاحی خالص فراهم می شوند.





روش های سترون سازی :

اهمیت موضوع رعایت شرایط استریل در طی انجام کشت بافت های گیاهی به قدری واضح است که تاکید بر آن توضیح واضحات است.

با رعایت چند مورد احتیاطی ساده می توان ضمن جلوگیری از آلودگی میکروبی محیط از هدر رفتن اوقات پر ارزش مصرف شده در آزمایشگاه به منظور تکرار کشت های آلوده شده ممانعت به عمل آورد.

در انتخاب محل اتاق کار سترون مهم ترین موضوع منحصر به فردی که باید دقیقا مورد توجه قرار گرفته شده باشد جلوگیری از جریان یافتن هوای معمولی بر روی محل کار استریل شده می باشد , زیرا جریان هوا با انتقال دادن اسپورها و ارگانیسم های آلوده کننده به اتاق کار سبب ایجاد آلودگی در کشتها می شود. اختصاص دادن یک اتاق کوچک اندرونی, اتاقی شبیه تاریکخانه عکاسی, به عنوان اتاق کار سترون شده روش بسیار مطلوبی است.

در این قبیل اتاقکها معمولا به منظور انهدام اجرام میکروبی موجود در هوا و سترون کردن سطوح داخلی اتاقک لامپ میکروب کش تولید کننده اشعه ماورا بنفش نصب می شود. اشعه این لامپ ها (که طول موج آن 253.7 نانومتر است) اجرام میکروبی را به آهستگی منهدم می کند, ولی بدلیل عدم نفوذ تشعشعات این لامپ ها به قسمت های عمقی و قسمت های گرد گرفته و سایه گیر اتاقک کار اجرام میکروبی این قسمتها از گزند این اشعه مصون می مانند. بهمین دلیل اگر چه استعمال این لامپ در اتاقک های کار کاملا مرسوم است, ولی تاثیر قطعی آن در ایجاد محیط کاملا عاری از میکروب مورد شک و تردید می باشد (18, و 11). عمر لامپ های ما وراء بنفش نسبتا کوتاه است . البته پس از متوقف شدن تولی اشعه ما وراء بنفش در طول موج 253.7 نانومتر این لامپ ها برای مدتی به تولید نور مرئی ادامه می دهند. در صورت وجود ابزار پلاستیکی در اتاقک کار از روشن کردن لامپ اشعه ما وراء بنفش خودداری نمود. ضمنا ادعا شده است که این لامپ ها ممکن است باعث تولید شدن مواد بازدارنده رشد در مدیوم کشت شوند. خلاصه اینکه استفاده از این گونه لامپ های میکروب کش باید بحداقل ممکن کاهش داده شده و نباید بسهولت جایگزین سایر روشهای سترون سازی شوند. کابینت های رومیزی مجهز به جریان هوای سترون شده بنحوی طراحی شده اند که در آنها جریان ملایمی از هوای الترافیلتره و سترون شده بطور مداوم از روی میز کار عبور داده می شود تا میزان تماس هوای معمولی آلوده به اجرام میکروبی با مواد و ابزار کشت بحداقل مقدار ممکن کاهش داده شود. به هنگام روشن کردن چراغ الکلی در داخل این قبیل کابینت ها باید موارد احتیاط رعایت شوند, زیرا که الکل به شدت آتش گیر است و جریان هوای داخل کابینت ممکن است شعله های آتش را به سمت محقق هدایت کند. ضمنا در حین انجام کشت پس از فرو برده شدن ابزار کار به داخل شیشه محتوی الکل اتانول یا الکل ایزوپروپانول 80 درجه ابتدا باید با استفاده از کاغذ صافی استریل الکل اضافی آنها گرفته شده و سپس آنها برروی شعله چراغ الکلی گرفته شوند. قبل از شروع عملیات سترون نیاز میز کار باید با حوله کاغذی آغشته به الکل اتانول و یا الکل ایزوپروپانول 80 درجه ضدعفونی شود. یکی دیگر از مسائل مبتلا به فعالیت های سترون نیاز و عمده ترین منبع آلودگی کشتها کثیف بودن دستهای محقق است. برای انجام دادن عملیات سترون نیاز شستشوی معمولی دستها با آب کافی نیست , بلکه ضروری است دستها تا آرنج بشدت و به مدت چندین دقیقه با آب گرم فراوان و صابون شستشو داده شوند. دستها را پس از شستشو و خشک کردن باید با محلول خیلی رقیق الکل اتانول یا الکل ایزوپروپانول ضدعفونی نمود.

به منظور سترون سازی ظروف شیشه ای مورد مصرف, ابزار کار, محلولهای غذایی, و مواد گیاهی می توان از روشهای متعددی مانند: حرارت خشک, حرارت مرطوب (بخار داغ), الترافیلتراسیون, و سترون سازی شیمیایی استفاده نمود.



روش حرارت خشک (آون) Dry heat :

این روش برای ضدعفونی کردن ظروف شیشه ای, ابزار فلزی, و سایر وسایل و موادی که در حرارت های بالا خراب نمی شوند(نمی سوزند) استفاده می شود. البته وسایلی را که در ساختمان آنها پنبه, کاغذ, و یا پلاستیک بکار رفته باشد نمیتوان با حرارت خشک ضدعفونی نمود. تیغ و چاقوهای جراحی و اسکالپل ها نیز نباید با این روش استریلیزه شوند, زیرا حرارت های بالا موجب کند شدن لبه برنده این وسایل میشود. اگرچه در ضدعفونی کردن وسایل با حرارت توصیه میشود که از آون های آزمایشگاهی استفاده شود,ولی می توان از کوره (فر) اجاق گاز و یا اجاق برقی خانگی نیز بهمین منظور استفاده نمود.

استریلیزاسیون با آون شامل سه مرحله مهم می باشد :

1- مرحله اول شامل زمان لازم برای گرم شدن کوره می باشد. برای گرم شدن کوره و رسیدن دمای محتویات آن به دمای استریلیزاسیون در همه قسمت ها مدت تقریبا یکساعت مورد نیاز است.

2- مرحله دوم عبارت است از زمان لازم برای استریلیزاسیون. زمان لازم برای استریلیزاسیون بر حسب دمای کوره متغیر است و عبارت است از 45 دقیقه در 160 درجه سانتیگراد, 18 دقیقه در 170 درجه سانتیگراد, 5/7 دقیقه در 180 درجه سانتیگراد, و 5/1 دقیقه در 190 درجه سانتیگراد .اگر دمای کوره حرارتی در یک درجه متعادل مثلا در 160 درجه سانتیگراد تنظیم شده باشد زمان لازم برای اجرای استریلیزاسیون (مجموع سه مرحله) تقریبا دو ساعت خواهد بود .



اسیدهای آمینه و آمیدها :

به استثنای اسید آمینه گلایسین (اسید آمینو استیک ), که جزو ترکیبات ضروری تعداد زیادی از مدیوم های کشت گیاهی می باشد , معمولا اسید آمینه دیگری در مدیوم های کشت مورد نیاز نمی باشد. اگر در مدیوم کشتی به وجود ازت آلی نیاز باشد برای تامین آن می توان از هیدرولیزات کازئین یا کازآمینواسیدها (Casamino acid ) به نسبت 05/0-1/0 درصد استفاده نمود. کازئین شیر را می توان بطرق مختلف هیدرولیز نمود. هیدرولیزات بدست آمده , که ساختمان شیمیایی آن بطور کامل روشن نشده است, شامل حداقل 18 نوع اسید آمینه متفاوت می باشد. اگر اثر اضافه کردن هیدرولیزات به مدیوم کشت مثبت باشد, بمنظور تعیین دقیق نوع اسید آمینه موثر باید آزمایش های متعددی با جایگزین کردن مخلوط های متفاوتی از انواع اسید آمینه ها و آمید ها بجای هیدرولیزات انجام داده شود. بدین ترتیب می توان نهایتا نیاز کشت را به نوع مخصوصی از ازت آلی مشخص نمود.

اجزای تشکیل دهنده مخلوط های مختلفی از اسید های آمینه و آمیدها , که تاکنون از آنها در مدیوم های کشت گیاهی استفاده شده است توسط هوانگ(Huang) و موراشیگ(Murashige) گزارش گردیده اند. برخی از اسید های آمینه و آمیدهایی که از افزودن آنها به مدیوم های کشت مکررا نتایج مثبتی حاصل گردیده است عبارتند از : اسید آسپارتیک- ال , آسپاراژین- ال , اسید گلوتامیک- ال , و آرژنین- ال. مقادیر بسیار اندک متیونین- ال اضافه شده به مدیوم کشت بمنظور افزایش بیوسنتز اتیلن بر روی تشکیل آوندهای چوبی اثر تحریک داشته است.

تاکنون نیاز کشت های گیاهی به نوکلئوتیدها اثبات نشده است , مکررا مشاهده شده است که پس از افزودن مجموعه ای از اسیدهای آمینه به مدیوم کشت رشد بافت متوقف می شود. علت این توقف رشد به رقابت متقابل آسیدهای آمینه مختلف نسبت داده شده است.

مکمل های آلی کمپلکس :

در کشت بافت های گیاهی از گذشته رسم بر این است که حداکثر تلاش بعمل آید تا از اجزای کاملا شناخته شده ای در تهیه مدیوم کشت استفاده شده و از استعمال هر گونه عصاره های خام طبیعی اجتناب گردد. امروزه بندرت از موادی مانند پپتون, عصاره مخمر, و عصاره جو در تهیه مدیوم های کشت استفاده می شود. اگرچه این طرز تفکر از نقطه نظر علمی منطقی بنظر می رسد, ولی هنگامی که از استعمال مدیوم کشت با اجزای شیمیایی مشخص نتایج مورد نظر حاصل نمی شود استفاده از عصاره های طبیعی نباید نادیده گرفته شود. همچنین بعضی از آب میوه ها نیز جزو مکمل های آلی مهم و موثر محسوب میشوند. انزر( Einser ) متوجه شد که رشد قطعات کشت شده چندین گونه از مرکبات در اثر افزودن آب نارنج در مدیوم کشت بمقدار زیادی تسریع می شود. آب گوجه فرنگی نیز به نسبت30 درصد تحت شرایط ویژهای بطور موثر مورد استفاده قرار گرفته است. مدیوم کشت ارکیده ها با افزودن عصاره میوه موز و روغن ماهی تکمیل شده است.

ذغال :

ذغال فعال شده می تواند تعداد زیادی از ملوکول های معدنی و آلی مدیوم کشت را بخود جذب نماید. این ماده در سیستم های کشت متعددی مورد استفاده قرار گرفته است. اگرچه نحوه تاثیر ذغال فعال شده دقیقا روشن نشده , ولی در مورد نحوه تاثیر آن نظریه های متعددی ارائه شده است. مثلا تعدادی از محققین معتقدند که این ماده نا خالصی های آگار را بخود جذب می کند. بنظر عده ای دیگر از دانشمندان این ماده ترکیبات شیمیایی ثانوی ترشح شده توسط بافت های کشت شده را حذف می کند و یا اینکه مقدار مواد تنظیم کننده رشد داخلی تولید شده را کنترل می کند. ضمنا ممکن است برخی از اثرات ذغال فعال شده ناشی از تیره رنگ کردن ماتریس زمینه و فراهم ساختن شرایطی مشابه با شرایط خاک در مدیوم کشت باشد.

همچنین گزارش شده است که افزودن ذغال فعال شده به مدیوم کشت موجب تحریک رشد جنین می گردد. از طرف دیگر تعدادی از محققین گزارش کرده اند که این ماده جذب کننده ممکن است بر روی رشد و مورفوژنز بافت های کشت شده تاثیر بازدارنده داشته باشد. البته نوع ذغال فعال بکار برده شده در نحوه تاثیر آن اثر بسزایی دارد, زیرا که خاصیت جذب کنندگی ذغال بر حسب فرآیند تولید آن متفاوت است. بعنوان مثال میزان کربن ذغال چوب بمیزان قابل توجهی از ذغال استخوان بیشتر است. همچنین ذغال استخوان محتوی ترکیباتی است که ممکن است بر روی بافتهای کشت شده تاثیر منفی داشته باشد.

منابع کربن :

کربن بعنوان منبع انرژی در همه مدیوم های کشت مورد نیاز می باشد. معمولا بمنظور تامین کربن مدیوم های کشت گیاهی با غلظت های 20-30 گرم در لیتر از ساکارز و یا گلوکز استفاده می شود.البته در موارد ویژه استفاده از غلظت های بالاتری از مواد قندی نتایج مطلوبتری ببار می آورد. بنظر می رسد که تقریبا همه کشت ها حداکثر مقدار رشد خود را در حضور قند دی ساکارید ساکارز نشان میدهند, ولی هنگامی که از دی ساکاریدها و یا منوساکاریدهای دیگر بجای ساکارز استفاده شود در رشد بافت کشت شده تغییرات قابل ملاحظه ای مشاهده می شود. اگرچه در اکثر آزمایشگاهها ساکارز را نیز توام با بقیه عناصر غذایی مدیوم کشت در اتوکلاو سترون می کنند ولی بدلیل تجزیه مقداری از ساکارز به گلوکز-D و فروکتوز-D ممکن است نتایج بدست آمده از چنین مدیومی با نتایج حاصله از مدیومی که ساکارز آن به روش فیلتراسیون سترون شده است کاملا متفاوت باشد. در برخی از مدیوم های کشت از سیکلیتول میو اینوسیتول به نسبت 100 میلی گرم بر لیتر بعنوان فاکتور رشد استفاده می شود. خلاصه اینکه نوع و غلظت ماده قندی مورد مصرف عمدتا به نوع بافت گیاهی مورد نظر و هدف آزمایش بستگی دارد.

مثلا نوع ئیدرات کربن بکار برده شده در مدیوم کشت می تواند بنحو قابل توجهی بر روی تشکیل آوند چوبی در بافت کشت شده موثر باشد. در واقع می توان با استفاده از گلیسرول یا میواینوسیتول , بعنوان منبع اصلی کربن خارجی, به نسبت 2 درصد موجبات شروع رشد آوند چوبی را فراهم نمود. البته باید توجه داشت که ساکارز معمولی کاملا خالص نبوده و در طی کریستالیزه کردن ساکارز نیز مقادیری ناخالصی مواد آلی دیگر و بویژه مقادیر بسیار اندکی اسیدهای آمینه در آن تولید می شود.

مواد تنظیم کننده فشار اسمزی (Osmoticum ) :

اختلاف فشار نسبی آب موجود در شیره واکوئل و مدیوم کشت مقدار آب جذب شده توسط سلولهای گیاهی کشت شده را کنترل می کند. عمده ترین اجزای مدیوم کشت که بر روی میزان آب قابل دسترس سلولهای گیاهی تاثیر می گذارد عبارتند از: غلظت آگار, غلظت منبع کربن, و غلظت ماده غیر متابولیتی که بعنوان اسموتیکوم به مدیوم کشت اضافه می شود. یکی از ویژگیهای کلوئیدی فرم ژله ای آگار ایست که می تواند آب را در داخل میسل های ژل جذب و نگهداری کند.

ئیدراتهای کربن نیز نه تنها بعنوان منبع کربن در متابولیسم سلولی عمل می کنند بلکه نقش مهمی را در تنظیم فشار اسمزی خارجی ایفا می کنند. در اکثر مدیوم های غذایی از یک ماده کم متابولیز شونده بمانند مانیتول یا سوربیتول بعنوان ماده اسموتیکوم خارجی استفاده میشود.

گزارش شده است که کشت های Fraxinus و احتمالا بعضی کشت های دیگر می توانند مانیتول را متابولیز نمایند. در روش استخراج پروتوپلاست ها و نگهداری کشتها در تحت شرایط انجماد از پلی اتیلن گلیکول (PEG) بعنوان اسموتیکوم استفاده می شود.

آب :

هر گونه آبی که برای تهیه مدیوم های کشت بکار برده می شود, منجمله آبی که در طول عملیات کشت مصرف می شود, باید دو بار تقطیر شده باشد و یا اینکه با روش حذف مواد معدنی تقطیر شود. در هر دو حالت , تقطیر در شیشه باید آخرین مرحله عمل باشد. تقطیر کردن صحیح آب یک فرآیند بسیار پیچیده است , زیرا در طول تقطیر اکثر مواد آلی فرار با وزن ملکولی سبک نیز توام با بخارات آب تقطیر می شوند. بونگا توصیه کرده است که برای حذف بعضی از این ملوکول های فرار بهتر است که آب مقطر تولید شده در 10-15 دقیقه اول تقطیر بیرون ریخته شود. بعضی ها پیشنهاد کرده اند که برای حذف این ملوکولهای فرار بهتر است از صفحات تعویض یونی استفاده شود. مع الوصف استفاده از این وسیله به سبب احتمال آزاد شدن برخی از ترکیبات آلی آلوده کننده (مانند برخی متابولیت های ترشح شده توسط میکروارگانیسم هایی که معمولا در داخل صفحات تعویض یونی رشد می کنند)پاره ای اشکالات فنی بهمراه دارد.

اصولا باید از ذخیره کردن دراز مدت آب مقطر در ظروف پلاستیکی پلی اتیلنی خودداری شود, زیرا ممکن است این گونه ظروف موادی آزاد کنند که نسبت به کشت خاصیت سمی داشته باشند. همچنین نباید آب مقطر را برای مدتی طولانی در ظروف شیشه ای پیرکس نگهداری نمود, زیرا ممکن است مقدار قابل توجهی باکتری در شرایط غیر استریل ذخیره سازی در داخل آب مقطر رشد نمایند. نگهداری دراز مدت آب مقطر استریل شده هم به هیچ وجه توصیه نمی شود.

ژنوم سیتوپلاسمی و تنوع سوماکلونال :

نمونه های کمی در تایید این که فرایند کشت بافت, باعث جهش ژنتیکی وراثت پذیر در ژنوم کلروپلاست یا میتوکندری می شود, وجود دارد.جهش های موثری در نر عقیمی کشت های ذرت و گوجه فرنگی مشاهده شده است که به احتمال بسیار زیاد DNA میتوکندریایی در هر دو گونه تحت تاثیر قرار گرفته است. در توتون , بعضی تغییرات مشخص در توالی DNA میتوکندریایی در کشت سوسپانسیون سلول ها رخ داده که این تغییرات توالی DNA در ایجاد تغییرات فنوتیپی در گیاهان باز زایی شده دخالت داشته اند.

دلایل تنوع اپی ژنتیک در کشت بافت :

یک جنبه مهم و مورد توجه در این قسمت تنوع اپی ژنتیکی است که در کشت بافت رخ می دهد. اغلب, هر نوع تغییر ایجاد شده در کشت را پایدار بوده اما قابل توارث نیست به عنوان تغییرات اپی ژنتیک مورد بر رسی قرار می دهند. فهم بیشتر تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در کشت , اخیرا منجر به تمایز بین این دو نوع تغییرات شده است. به عنوان مثال, جهش ژنتیکی به صورت تصادفی و به میزان بسیار کمتری در مقایسه با تغییرات اپی ژنتیکی رخ می دهد. تغییرات ژنتیکی معمولا پایدار و توارث پذیر هستند. تغییرات اپی ژنتیک نیز ممکن است منجر به صفات پایدار شوند, با این حال, بازگشت به حالت ناپایدار تحت شرایط غیر انتخابی می تواند به میزان بالایی صورت گیرد. صفات اپی ژنتیک از طریق فرایند میتوز اغلب به صورت پایدار منتقل می شود اما این انتقال بندرت از طریق میوز صورت می گیرد و سطح ایجاد صفات اپی ژنتیک مستقیما مرتبط با فشار گزینشی است که بر سلول ها وارد می شود.