مقاله مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی در 50 صفحه ورد قابل ویرایش

فهرست مطالب

عنوان صفحه

بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه................................................................................................................

1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان.....................................................

2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باکتری...............................................

3-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکروپیپت.....................

4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انکوبه کردن آن در سیستم بافری...........

5-1- انقال ژن از طریق اسپرم با الکتروپورشن در سیستم بافری................

6-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق الکتروپورش.....................................

7-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکرواینجکشن..............

8-1- بررسی امکان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد.............................
بخش دوم : دست کاریهای کروموزومی در ماهیان

1-2- دست کاریهای جنسی.............................................................................

1-1-2- دست کاریهای جنسی با تکنیک ژینوژنز............................................

2-1-2- دست کاریهای مجموعه کروزومی به وسیله تکنیک اندروژنز..........

2-2- پلوئیدی...................................................................................................

1-2-2- تریپلوئیدی.........................................................................................

2-2-2- تتراپلوئیدی........................................................................................
بخش سوم: کلونینگ

مقدمه................................................................................................................

1-3- ایجاد کلون به وسیله دوژینوژنز متوالی................................................

2-3- کلون کردن به وسیله ترکیبی از اندروژنز و ژینوژنز...........................

3-3- جابجایی هسته........................................................................................

4-3- جابجایی سلولهای سوماتیک جنینی به جنین دیگر.................................

5-3- دورگه گیری..........................................................................................

4- منابع............................................................................................................




بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه:

یکی از زمینه های که امروزه بیوتکنولوژیست ها روی آن تحقیق می کنند ایجاد گونه های ترانسژنیک است. طبق تعریف ترانسژنیک موجودی است که، دارای DNA نو ترکیبی باشد. به طوری که در ژنوم آن موجود ژن نو ترکیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یکی از جنبه های تولید ترانسژنیک و انتقال DNA به زاده های هدف بعدی می باشد. در این زمینه تکنیک میکرواینجکش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همکاران در سال 1980 گزارش شد. در این تکنیک یک لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد کردن DNA نو ترکیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به کار گرفتند. در همین سال میکروانجکش مستقیم DNA نو ترکیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیک مورد استفاده قرار گرفته است. طوری که ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سرکه، خرگوش و خوک کرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همکاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مرکزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق کردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده کرند. در همین سال روکونس (Rokkones) تکنیک میکرواینجکشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تکنیک ابتدا به کمک یک وسیله نوک تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA نو ترکیب به کمک پی پت ریز تخم شدند به طوری که به کیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای کامل را مشخص کردند. چوروت (Chourrout) و همکاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به کار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملکولهای DNA میزبان پیشنهاد شده که این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از جمله با تریپسن کوریون را برداشته و تزریق میکرواینجکشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی کوچک مدوکا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیک مطرح کرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن کریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میکرواینجکشن وارد کرد. به علت کوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میکرواینجکشن مشکل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور روشهایی جهت غلبه بر این مشکل به کار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem) و همکاران ژن هورمون رشد انسان را به کمک وکتور مناسب از طریق میکروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق کردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همکاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیک انجام شد. همچنین تکنیکهای دیگر شامل الکتروپورشن (Electroporation) شلیک ذرات ژن Shatagun بر روی تخمک و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میکر واینجکشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن کم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیک است علاوه بر این از دیگر مشکلات آن این است که در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میکرسکوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم تزریق می کنند.

در مجموعه تحقیقات انجام شده، میزان باقی ماندگی جنین هایی که مورد تزریق قرار گرفته اند بین 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و کارآیی میزان بیان ژن بین 3 تا 70 درصد بوده است. باقی ماندگی جنین ها و کارایی بیان ژن وابسته به فاکتورهایی نظیر سیستم بافری، غلظت DNA و روش های مورد استفاده در تزریق می باشد. لذا در مراحل بعدی غلبه بر این مشکلات مورد توجه قرار گرفت به طوری که ضمن ساده کردن تکنک و کم کردن هزینه ها کارآیی را افزایش می دهند تا در عمل بتوان در تکنولوژی تکثیر و پرورش آبزیان تعداد زیادی از ماهیان ترانسژنیک را ایجاد کرد. بنابراین روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بکارگیری اسپرم به عنوان یک ناقل مسئله جدیدی نیست بلکه در سال 1971 براکت (Brackett) با وارد کردن ژن خارجی به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فریمن (Fareeman) بر روی ماکیان این تحقیق را انجام داده اند و در سال 1989 لویترانو (Lavitrano) این تکنیک را بر روی موش به کار گرفته است. در سال 1992 کهو (Khoo) تکنیک استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد کردن ژنهای جدید به ماهی زبر به کار گرفت. همچنین در سال 1993 ایکسی (Xie) و همکاران جزئیات انتقال ژن از طریق اسپرم به کمک التروپورشن (Electroporation) بر روی ماهیان لوچ (Loach) و کاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سین) Sin و همکاران انتقال ژن به ماهی چنوک (Chinook) را با همین تکنیک شرح دادند. در این نوشتار جزئیات دستکاریهای ژنی در ماهیان با ذکر مثالهایی بررسی شده است.

1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان
گزارشهای اندکی در ارتباط با تحقیقات به کارگیری پروموتر از ماهی در دسترس است. در ماهی قزل آلای رنگین کمان دو فرم مشابه از ژنهای متالوتیونین بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بیان ژن گزارشگر در محیطهای کشت سلولی است. ولی درباره این ویژگی پروموترژن B در سلولهای ماهی اطلاعات کمی وجود دارد. به منظور طراحی و کتورهای مناسب برای ما هی و مطالعه تنظیم بیان ژن در داخل بدن و شرایط آزمایشگاهی پروموترن ژن B متالوتیونین ماهی قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بیان ژن در لاینهای سلولی انسان و ماهی توسط هونگ (Hong) به کار گرفته شد. به همین منظور وکتور بنام PtMTb – CAT که دارای 6/4 کیلوباز است طراحی گردید. حدود 261 حفت باز وکتور مربوط به پروموترژن B متالتیونین قزل آلای رنگین کمان (tMTb) کیلو باز آن ژن کلرامفنیکل استیل ترانسفراز (CAT) و سیگنال پلی ادنیلاسیون ویروس SV40 و همچنین 7/2 کیلو باز آن قطعه ای مربوط به پلاسمید PUC18 بوده است همچنین طراحی آن بر پایه ساختمان pBL – CAT تکمیل شده بود. به طوری که طراحی BL پرایمری دارای سکانس اولیگونکلئوتیدی بر اساس ردیف نکلئوتیدهای سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهی قزل آلا بوده و دارای محل ویژه ای جهت برش توسط آنزیم EcoRI بوده است. همچنین در ساختمان پلاسمید ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازی پروموتر tMTb در جلوی ژن CAT در ساختمان CAT pBL- قرار گرفته است. در کنار این چهار وکتور دیگر طراحی گردید، که شامل pBL-CAT2-1 که در آن پروموتر تیمیدین کیناز (TK) ویروسی در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT3-2 بر اساس pBL-CAT2 که در آن پروموتر TK برداشته بود طراحی شد pTK-CAT2E-3 که در پلاسیمید PBL-CAT2 تعداد 72 جفت باز تکراری از اینهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتدای ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 که تعداد 850 جفت باز دارای محل ویژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتیونین IIA انسانی (HmtIIA) به ژن CAT در ساختمان
pBL-CAT3 اضافه شده بود این وکتورها به روی 4 لاین سلولی ماهی و یک لاین انسانی به کار گرفته شدند. طوری که در آن سلولها با میزان 5/3 پیکومولار از DNA پلاسمید آلوده شدند جزئیات نتایج در جدول شماره یک آمده است.

جدول 1- سنجش فعالیت پروموتر در یک لاین سلولی انسان و چهار لاین سلولی ماهی

-8- بررسی امکان وراثت ژن منتقل شده به نسل های بعد

کهو و همکاران در سال 1992 پلاسمید pUSVCAT که حاوی ژن گزارشگر CAT بود از طریق اسپرم به ماهیان زبراتو منتقل نموند. نتایج حاصله نشان داد که پلاسمید حاوی ژن در میان زاده های نسل اول و دوم ظاهر شده است. پلاسمید در طی لقاح اسپرم با تخمک قابلیت انتقال به نسل جدید را داشته است. همچنین در بسیاری از حالات پلاسمید معرفی شده در میزبان اغلب به صورت خارج کروموزومی باقی می‌ماند. البته قطعاتی از DNA الگو ممکن است وارد ژنوم شوند و حالت غیر موزائیک در یکی از مجموع 7 والد ترانسژنیک ماهی زبرا دیده شد. ولی شش تای دیگر حالت موزائیک داشته اند.

تصویر 14- نتایج انتقال ژن از طریق اسپرم با سیستم انکوبه کردن در بافر روی ماهی زبرا که در آن 7 ماهی ترانسژنیک با ماهیان غیر ترانسژنیک لقاح داده شدند. P (والدین) ، F1 (نسل اول) ،‌F2 (نسل دوم)،‌دایره مولد ما ده، مربع مولد نر ،‌مثلث جنسیت ناشناخته رنگ سیاه نشانه ترانسژنیک است.

علاوه بر این دولین (Delin) و همکاران در سال 1995 ژن هورمون رشد ما هی آزاد چنوک با پروموتر ضد انجماد ماهی روغنی اقیانوس (Ocean pout) را به ماهی آزاد کوهو (Coho) منتقل نموند. نشان داده شد که، ژن منتقل شده در نسل اول روی رشد ماهیان اثر داشته است. در ادامه این تحقیق 5 تا از ماهیان نر ترانسژنیک تولید شد که حاوی ژن منتقل شده بوند. (OPAFPGHC) و به حد بلوغ رسیدند برای لقاح تخمکاری ماهیان طبیعی مورد استفاده قرار گرفتند زادهای حاصله بعد از مرحله لاروی یعنی در شروع مرحله الوین (Alevins) دو فنوتیپ مشخص را نشان دادند. به طوری که اکثر بچه ماهیان رنگ طبیعی قهوه ای مشابه ماهی والد داشته اند در حالی که تعداد دیگری از آنها دارای فنوتیپ رنگ سبز بوند. اگر چه این اختلاف رنگ زود گذر بود و در مرحله بعد یعنی فرای (Fry) رنگ قهوه ای در ماهیان غیر ترانسژنیک کمتر می شد. بررسیها DNA با PCR نشان داد که، فنوتیپ سبز با حضور ژن OPAFPGHC مرتبط است بنابراین در تحقیق از رنگ سبز به عنوان شاخصی برای تشخیص ورود ژن استفاده شد بررسیها ثابت کرد که نرهای ترانسژنیک قادر به انتقال ژن وارده از طریق جرم لاین به سلولهای اسپرم می باشند بنابراین پیشنهاد شده که ممکن است، ورود DNA منتقل شده به کروموزمی میزبان صورت گرفته باشد یا اینکه همانند سازی DNA آن به صورت خارج کوموزمی صورت گرفته و در طی تقسیمات میوزی به سلولهای بعد منتقل شود. فرکانس انتقال آن در این آزمایشات کم و در حد زیر 20 درصد بوده است. این فرکانس پائین ناشی از این است که 50 درصد از سلولهای جرم لاین اولیه که وارد مرحله تقسیم میوزی شده اند ژن منتقل شده را دریافت کرده اند. فرکانس های پائین تر از این ممکن است از این مسئله ناشی شده باشد که تمام سلولهای اسپرم ژن منتقل شده را دریافت نکرده باشد. در حقیقت یک موزائیسم به طور گسترده در ارگانیسم های موجود ترانسرنیک اتفاق می افتد طوری که در بافتهای سوماتیک مشابه جرم لاینها این موزائیسم مشاهده می شود. در ارتباط با ظهور رنگ سبز در مرحله الوین در ماهیان ترانسژنیک پیشنهاد شده که ناشی از تشدید رشد و نمو و رنگ زایی (Pigmentation)بوده است. پیش از شروع تغذیه به افزایش رشد طولی و وزنی ماهیان ترانسژنیک با توجه اینکه هیچ منبع انرژی کمکی داده نشده است. منجر به این نتیجه گیری شده است که، افزایش بیان ژن هورمون رشد ممکن است میزان رشد را تحت تأثیر قرار دهد یا بر کارایی تبدیل انرژی ذخیره در زرده تخم اثر گذارد. اینکه آیا افزایش رشد به طور مسقیم ناشی از عملکرد هورمون رشد است یا به واسطه ای نظیر عمل فاکتور شبه انسولین (Insulin like – growth factor) GF و همکارانش در سال 1992 پیشنهاد کردند که بیان ژن IGF در طی مرحله لاروی آزاد ما هیان در رشد اولیه نقش دارد. همچنین نشان داده شده که، تخم های آزاد ماهیان از منشاء مادری دارای هورمون تیروئید است که در رشد جنین نقش دارد به طوریکه در این ماهیان هورمون تیروئید T3 به طور وضوع سبب افزایش رشد می شود. علاوه بر این مشخص شده است که هورمون رشد در دوران جنینی با اثر روی فعالیت آنزیم T4 دایو دیناز De- iodinase سبب افزایش تبدیل T4 به T3 و در نتیجه افزایش رشد می‌شود و IGF شبیه مهره داران عالی سبب افزایش رشد کارتیلاژ می شود.